バイオサイトジェンは包括的な薬力学(PD)研究サービスを提供しており、in vivo薬効の評価をサポートしています。

フローサイトメトリー法で細胞表面と内部のマーカーの解析して腫瘍などの組織中の免疫細胞の変化を検査します。

単一あるいはサイトカイン/ケモカインの解析

RNA発現の解析

免疫組織化学(IHC)解析

受容体占有率(RO)測定

事例1:B-hCD137(4-1BB)マウスのMC38モデルによる腫瘍組織浸潤リンパ球(TILs)の解析

腫瘍組織浸潤リンパ球(tumor infiltrating lymphoeytes,TILs)は近年活発に研究されてる腫瘍エフェクター細胞であり、主に単球や多核免疫細胞(すなわちTBNK細胞、マクロファージ、好中球、DC細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球など)が含まれています。下記の図1に示すように、腫瘍の成長を促進する細胞もあれば、腫瘍の成長を抑制する細胞もあります。その細胞の構成は、腫瘍の種類や治療法の違いによって異なっています。腫瘍湿潤リンパ球の構成は腫瘍増殖の制御メカニズムを明らかにするには重要となっており、治療後の特定細胞型の変化は、薬力学的(PD)マーカーとしても利用されています。

バイオサイトジェンは多色フローサイトメトリー法で腫瘍湿潤免疫細胞の解析サービスを提供しています。これらのサービスは多様のシンジェニックマウスモデル(ヒト化マウス・重度免疫欠陥マウスなど)を用いて、TIL プロファイルをふくむ腫瘍湿潤免疫細胞プロファイルサービスを全世界の製薬企業及び臨床研究機関に提供しています。


癌症

フローサイトメトリー法によるB-h4-1BBマウスの腫瘍湿潤免疫細胞の解析


典型流式细胞仪


Flow cytometry analysis of tumor infiltrating immune cells. MC38 cells (0.5 M) were subcutaneously inoculated into B-h4-1BB mice, where the extracellular domain of human 4-1BB (CD137) replaces that of mouse 4-1BB via genomic knock-in. Grouping (n=3) and dosing started when tumor volume reached approximately 300 ± 50 mm3. Tumors were collected for TIL profiling 2-4 days after one dose of anti-human 4-1BB antibody (Ab1, Ab2) at 3 mg/kg at day 0.

Antibody Ab1 treatment led to marked decrease of Treg cells and increase of CD8/Treg ratios 2-4 days post dosing. Expression of human 4-1BB in CD4, CD8, Treg, and CD11b cells was also decreased significantly after Ab1 treatment. In contrast, treatment of antibody Ab2 resulted in no change in Treg or CD8/Treg ratios and less changes in 4-1BB expression in CD4 and Tregs. Ab2 did lead to significant decrease of 4-1BB in CD11b+ cells. The results suggest that Ab1 has a more favorable anti-tumor PD profile in MC38 tumors via reducing the Treg population in tumor.

事例2:B-hCD40マウスのサイトカイン測定

サイトカインとは多種類の細胞より生じる低分子量可溶性タンパク質の一群です。これらのタンパク質にはインターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、腫瘍壊死因子(TNF)などが含まれ、人体の免疫反応を調節する上で重要な役割を果たしています。CD40は主に抗原提示細胞(APC)で発現する受容体であり、T細胞表面に発現するリガンドCD154CD40L)やアゴニスティック抗CD40抗体との結合により、APCT細胞を活性化されまして、多種類のサイトカインが生じされます。バイオサイトジェンはマウスCD40細胞外ドメインをヒトCD40に置き換えて、B-hCD40マウスを作製しました。抗ヒトCD40抗体selicrelumabはMC38腫瘍モデルで検証されましたAB)他の抗ヒトCD40抗体による治療のMC38/B-hCD40モデルでのマルチサイトカインの解析は、これらのサイトカインの発現はそれそれ違うことを示しています(C)。サイトカイン介在の毒性はCD40関連の臨床治療法開発に対して重要な安全性の項目であり、サイトカインプロファイリングはサイトカインを介した毒性低減する効果的な抗ヒトCD40抗体の選択に役立ちます。



鼠结肠癌

Murine colon cancer MC38 cells were subcutaneously implanted in homozygous B-hCD40 mice. Mice were grouped when the tumor sizes reached approximately 150±50 mm3 (n=5). Selicrelumab (anti-human CD40 antibody) significantly inhibited tumor growth, validating that the B-hCD40 mice are a useful model for in vivo pharmacology studies of anti-human CD40 antibodies. Tumor volume: mean ± SEM (A).  Body weight: mean ± SEM (B).

Cytokine profiles after anti-human CD40 antibody treatment of MC38-bearing B-hCD40 mice. Multiplexed cytokine detection was performed with LEGENDplexTM (Biolegend). Anti-human CD40 antibody treatments led to significant increase of IFN-γ, TNF-α, MCP-1, and IL-27. Note that the two antibodies gave different profiles. Not only could the difference in cytokine profiles provide insights on the mode of action by individual anti-human CD40 antibodies, but also they could be used as PD biomarkers to inform selection of safe anti-CD40 therapeutics.

事例3:B-hCD3eマウスの特性ではリンパ球中のCD3+T細胞の割合が抗体活性化誘導アポトーシス(Activation-induced cell death, AICD)効果のPDマーカーであることを示しています。

B-hCD3e-小鼠

Murine colon cancer MC38 cells were subcutaneously implanted in C57BL/6 (A) and B-hCD3e (B) mice. Mice were grouped when the tumor size reached approximately 150 ± 50mm3 (n=5). The mPD-1 antibody significantly inhibited tumor growth, whereas the specific CD3 mouse antibody led to increased tumor growth. The enhanced tumor growth by anti-human CD3e antibody was probably due to antibody-induced cell death (AICD), as anti-human CD3e treatment resulted in loss of CD3 T cells in blood and spleen (C). These results indicated B-hCD3e mice are responsive to anti-human CD3e modulation and validated the B-hCD3 mouse model as a useful tool to study anti-human CD3e antibody-based therapy.



The ratio of B cells and T cells in the blood of B-hCD3e mice was detected by flow cytometry (C). Lymphocytes were isolated from peripheral blood at the 48 hours. In the anti-human CD3e antibody treated group, the proportion of CD3 T cells was significantly decreased. This depletion was specific to anti-human CD3e because anti-mouse CD3e, anti-mouse PD-L1, or an IgG control antibody did not show depletion of T cells (C, right). Further, no change in B cells as percent of leukocytes was also not changed (C, left). This observation was consistent with activation induced cell death (AICD).

脾表

 

Table 1. Group and treatment information.

Strains of miceGroupTreatment
B一hCD3eG1hCD3 antibody (OKT3)
G2CD3/CD19 Bispecific antibody
G3blinatuomomab
G4PBS
C57BL / 6G5mCD3 antibody (145-2C11)
G6PBS

The ratio of T cells in spleen and blood were analyzed at 24h, 72h and 168h by flow cytometry.



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