CRISPRプラスミドの構築

CRISPR-Cas9技術はsgRNAの設計と構築がキーポイントであり、sgRNAはターゲットの特異性を決定します。バイオサイトジェン社の専門技術チームはsgRNAを慎重に設計検証し、高い特異性と活性を確認した上で、次のステップに入ります。

サービス内容

sgRNA Targeting SpeciessgRNA PromoterPlasmid Screening MarkersbDeliverablesDelivery CriteriacOptional ServicesdDelivery Time
Rat, Mouse, Human, Primate, Other Mammals. aU6

T7

PuroR

PuroR

Plasmid

Sequencing file

Quality report

Total amount > 5 μg

Concentration > 50 ng/μL

Enzyme digestion validation

Sanger sequencing

sgRNA efficiency determination10 business days

a.ラット、マウスと他の動物ターゲティングsgRNAのデザイン

b.その他耐性遺伝子及びGFPレポーター遺伝子マーカー

c.異なる数量のプラスミド、エンドトキシンフリーのプラスミドマキシプレップ

d.in vitro sgRNAの解析サービス

サービスプロセス

1.sgRNAターゲティング遺伝子の検証

2.sgRNAの設計及びお客さまによる確認

3.プラスミドの構築と検証

4. プラスミドの発送及び品質報告

CRISPR活性の測定

sgRNAの設計後、高活性を持つsgRNAを早速正確に選択することは非常に重要です。バイオサイトジェンは高感度のUCA測定法を開発しまして、in vitroでsgRNA活性を簡単に、速く測定します。。UCAメソッドは、シングルストランドアニーリング(SSA)メカニズムに基づいて、ハイスループットという特徴を兼ね備えております。

技术-UCA方法

 Figure 1. Schematic diagram of CRISPR/Cas9 activity determination using SSA mechanism.

CRISPR / Cas9真核生物発現プラスミドとpUCAプラスミドが細胞に共に導入した後、Cas9-sgRNA複合体が生成し、pUCAプラスミド上のsgRNAターゲット部位を切断し、SSA DNA修復メカニズムが働き、ルシフェラーゼ(er)の相同相補配列がルシフェラーゼの完全なコード配列を形成すると、この遺伝子が発現します。 ルシフェラーゼ活性はsgRNA活性を示し、 ルシフェラーゼシグナルが高いほどsgRNA活性が高くなります。

今のsbRNA設計ツールではsgRNA活性の予想が可能になっていますが、予想の結果と実際の活性の間の差は大きいです。ですので、後続の実験成功率を確保するため、実験を通じてsgRNA活性を検証する必要があります。

弊社のデータはUCA検査法でsgRNAのin vitro活性を十分に予測しております。この方法はすでに影響力の高い学術雑誌にも引用されています[2,3]。バイオサイトジェンのUCAシステムで検査された高いsgRNA活性はCRISPR-Cas9のゲノム編集の成功の近道になります。

サービスの優位性

1.高効率、高速:sgRNAの設計から活性測定まで2週間

2.簡便、正確かつin vivo活性に近い

3.種間の制限がない

[1]. Mashiko, D, et al. “Feasibility for large-scale mouse mutagenesis by injecting CRISPR/Cas plasmid into zygotes. ” Development Growth & Differentiation 56.1(2014):122.

[2]. Wu M, Wei C, Lian Z, et al. Rosa26-targeted sheep gene knock-in via CRISPR-Cas9 system[J]. Scientific reports, 2016, 6.

[3]. Lin, Zhimiao, et al. “Stabilizing mutations of KLHL24 ubiquitin ligase cause loss of keratin 14 and human skin fragility.” Nature Genetics 48.12 (2016): 1508-1516.

ドナープラスミドの構築

バイオサイトジェンは10数年のゲノム編集の経験を持ち、数千匹のマウスやラット及び細胞株プロジェクトを手掛けてきました。ESC/EGEを基盤とするゲノム編集のターゲティングベクターとTol2トランスポゾンベクターを用い、プラスミドの設計及び構築のサービスをより早く提供することが出来ました。

サービス内容

SpeciesaDeliverablesDelivery CriteriaOptional Services

Rat

Mouse

Cell line

Plasmid

Sequencing file

Quality report

Total amount > 5 μg

Concentration > 50 ng/μL

Enzyme digestion validation

Sanger sequencing

Endotoxin-free maxiprep plasmid

Pronucleus injection plasmid preparation

   サービスのプロセス

1.ターゲティング遺伝子の確認、ゲノム編集戦略と計画

2.プラスミド配列の設計並びにお客さまによる確認

3.プラスミドの構築と検証

4.プラスミドの発送及び品質報告

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