ゲノム編集の策略

バイオサイトジェンの専門技術チーム及びBDは、研究者からの動物モデルの依頼をご対応させていただきます。

カスタマイズモデルのゲノム編集の戦略は以下の内容になります:

全身性の遺伝子ノックアウト

コンディショナルノックアウト

遺伝子ノックイン

コンディショナルノックイン

Cre(ERT2)ノックイン

点突然変異

タグとレポーター遺伝子のノックイン

Rosa26遺伝子座ノックイン

Tol2トランスジェニック

ご注意:ESC/HR技術と比べ、CRISPR-Cas9を基盤とするEGETM技術で構築した動物モデルは、通常スクリーニングマーカーの必要はありません。以下の戦略の中で、伝統的なESC/HR技術では選抜マーカーが必要ですが、EGETM技術では必要ないです。下記の戦略はESC/HR技術を基盤としています。

全身性の遺伝子ノックアウトモデル

全身性の遺伝子ノックアウト(KO)マウスモデルでは、ターゲット遺伝子のエクソンを全て削除(EGE™法)するか陽性選抜マーカー(一般的にはネオマイシン)を用いて置き換えるかによって遺伝子の発現を不活性化します。全身性のノックアウトマウスの組織ごとのターゲット遺伝子をノックアウトします。組織では目的の遺伝子がすべての破壊されています。

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コンディショナルノックアウトモデル

Cre-LoxP/Flp-Frt組み換え酵素(リコンビナーゼ)システムを用いてーゲット断片の両側にLoxP(あるいはFrt) 配列を差し込んで、コンディショナルノックアウトモデル(cKO)を作製します。Floxマウス及び組織特異性を有するCreあるいはFlpマウスと交配させ、LoxP遺伝子座の配列を組織特異的に次世代マウスのゲノムから取り除きます。LoxP遺伝子座は通常ATG含むエクソンのイントロン下流に差し込み、隣接するエクソンを除去すると、フレームシフトが起こり、タンパク質の発現を妨害されます。

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遺伝子ノックインモデル

全身性の遺伝子ノックインマウスモデルは変異あるいは外来性DNA配列をマウスのゲノムの特定部位にを組み入れます。このモデルは突然変異を導入されると、 遺伝病を模倣することができます、各種タンパク質(EGFP、mRFP、mCherry、YFP、LacZ及びFlag等)のマーカーを付けて遺伝子の発現をモニタリングします。

EGETM技術によるN末端ノックインマウスモデルの作製

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EGETM技術によるC末端ノックインマウスモデルの作製

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コンディショナルノックインモデル

コンディショナルノックインモデルはflox(あるいは条件)の対立遺伝子を含むマウスをCreの発現マウスと交配させて、外因性遺伝子が組織特異的な発現を可能にします。

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Cre(ERT2)誘導マウスモデル

CreリコンビナーゼはloxPサイトに隣接するDNAフラグメントを組織特異的の削除を仲介します。したがって、Creマウスモデルでは、Creプロモーターに基づいて、組織特異的な遺伝子ノックアウトが可能です。ERT2配列はエストロゲン受容体ターゲティング遺伝子であり、タモキシフェンによってERT2の核移行と活動を制御しています。ですので、タモキシフェン投与によってCre活性と遺伝子欠失を一時的制御または誘導を可能にします。

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点突然変異モデル

通常の点突然変異

従来の点突然変異マウスは遺伝子のノックインモデルであり、そのマウスDNAの中一つもしくは複数のヌクレオチドが変異ヌクレオチドに置換され、タンパク質配列のアミノ酸変化またはフレームシフトが発生します。 点突然変異ノックインモデルは、タンパク質内の特定のヌクレオチドまたはアミノ酸の役割を研究するために、又は、人の遺伝病のモデルとして広く使用されています。

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コンディショナル点突然変異

コンディショナル点突然変異マウスモデルは、特定の条件が満たされたときに点突然変異を導入します。 下記の設計戦略では、Creリコンビナーゼの活性によって、点変異を組織特異的にゲノムに導入されます。 以下には 2つの主要な設計戦略を示しています:

二重LoxP(Flex)コンディショナル点突然変異ノックイン

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コンディショナル点突然変異ノックイン

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ヒト化モデル

マウス遺伝子のノックアウトとヒト化遺伝子のノックインを同時に行われまして、ヒト化マウスモデルを構築し、人の疾患症機制と治療為の研究を行っています。

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Rosa26遺伝子座ノックインモデル

従来のトランスジェニックマウスモデルは、プラスミドの前核注入によって構築され、多くの初代マウスを得ることができます。初代マウスらはそれぞれかなり異なり、統合コピー数と遺伝子座の違いにより、実験結果は再現できない場合があります。現在、ほとんどの研究者は、サイト特定的の統合戦略を使用して、遺伝子編集マウスモデルを構築しています。 Rosa26はほとんどの組織で発現し、非必須核RNAをコードするため、最も使用されてる「セーフハーバー」遺伝子座です。Rosa26遺伝子座で外来性配列の上流にLoxP-3XSTOP-LoxP配列を挿入されると、外来性遺伝子は条件付きで発現し、このモデルはCre削除子と交差します。 H11、TIGREなど他のセーフハーバーがいくつかあります。

Rosa26遺伝子座ノックインモデル

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Hipp11遺伝子座ノックインモデル

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Tol2トランスジェニックモデル

Tol2マウスモデルはTol2トランスポザーゼの活性を利用して遺伝子改変マウスを作製します。Tol2トランスポザーゼシステムは遺伝子の整合率を高めるだけではなく、遺伝子座の特異性も、塩基の偏りもありません。

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